Die Hauptfiguren des Stücks sind die beiden Landstreicher Estragon und Wladimir, die an einem Ort ihre Zeit damit verbringen, auf Godot zu warten. Godot selbst erscheint allerdings nie und das Warten auf ihn ist anscheinend vergeblich. Am Ende eines jeden Aktes erscheint ein Junge, der verkündet, dass sich die Ankunft von Godot weiter verspätet. Spätestens dann keimt in den beiden der Zweifel an ihrer Situation auf, der sich in diesem mehrfach in dem Stück wiederholenden Dialog ausdrückt, doch können sie ihr trotzdem nie entfliehen:

Estragon: Komm, wir gehen!

Wladimir: Wir können nicht.

Estragon: Warum nicht?

Wladimir: Wir warten auf Godot.

Estragon: Ach ja.

Bis zu dem Ende des Stückes wird nicht klar, wer Godot eigentlich ist und warum die beiden auf ihn warten. Er wird damit zu dem Symbol für das Warten und das Ungewisse schlechthin. Die Zeit vertreiben sich die beiden Protagonisten mit Belanglosigkeiten und dem Diskurs über ihre Situation, ohne jemals Klärung zu erlangen.

Estragon: Wir finden doch stets was, um uns einzureden, daß wir existieren, nicht wahr Didi?

Wladimir: Ja ja. Wir sind Zauberer.

"Warten auf Godot" steht daher auch für die Frage nachdem Sinn des Lebens, gilt als Ausdruck des existenzialistischen Ansatzes von Beckett und als Beispiel für Absurdes Theater.

Der Titel "Warten auf Godot" soll angeblich auf eine "Tour de France"-Etappe zurückgehen, die sich Beckett irgendwo in Frankreich ansah. Als die Radrennfahrer alle vorbeigerauscht waren, wollte Beckett gehen. Einige der Zuschauer blieben aber stehen. Auf die Frage, worauf sie denn warten bekam er die Antwort: "Wir warten auf Godeau!" Godeau war der langsamste Fahrer des Rennens.